Antinuklearna antitijela (ANA) predstavljaju organ-nespeciična antitijela i vrlo su heterogena populacija sa preko stotinu deinisanih antigenskih speciičnosti usmjerenih prema antigenima jedra i citoplazme. Predstavljaju najčešće detektovana autoantitijela u serumu oboljelih od autoimunskih bolesti, ali i u serumu ljudi koji nemaju autoimunsku bolest.
Metoda indirektne imunoflorescencije na HEp-2 supstratu predstavlja tehniku zlatnog standarda, jedinu preporučenu, za detekciju antinuklearnih antitijela i predstavlja prvi postupak u jednom veoma složenom dijagnostičkom algoritmu za sistemske bolesti vezivnog tkiva. Kada je otkrivena, prije 50-ak godina, koristio se supstrat jetre pacova, a već dugi niz godina koristi se HEp-2 supstrat (supstrat malignih ćelija humanog epitelnog porijekla).
Ukratko, metoda IIF izvodi se tako što se razblažen serum pacijenta inkubira sa Hep-2 ćelijama iksiranim na mikroskopskoj pločici. Zatim se nakon procesa pranja, vezana autoantitijela pacijenta dokazuju primjenom antiimunoglobulinskih antitijela obilježenih luorohromom koja se vezuju za vezana antitijela pacijenta. Preparat se posmatra pod luorescentnim mikroskopom. Obrazac luorescencije odgovara obrascu vezanih antitijela za određene nuklearne ili citoplazmatske antigene, i korelira sa speciičnošću prisutnih autoantitijela koja mogu biti dijagnostički značajna za pojedine sistemske bolesti. Važno je naglasiti da nalaz određenog obrasca u većini slučajeva nije dijagnostički speciičan za samo jedno određeno antitijelo ili pak bolest. Obrasci su samo indikatori postojanja autoantitijela od kojih neka mogu biti relevantna za dijagnozu pojedinih bolesti. S obzirom na to da jedan obrazac ne znači prisustvo antitijela jedne speciičnosti, odnosno da više različitih antitijela može da bude odgovorno za nalaz istog ili sličnih obrazaca, u slučaju nalaza određenih obrazaca neophodno je uraditi dodatne potvrdne testove za dokazivanje ili isključivanje postojanja speciičnih, dijagnostički relevantnih antitijela (ELISA, imunoblot…). U rutinskoj praksi obično detektujemo oko 30 obrazaca, mada ih je opisano više od 50. U imunološkom izvještaju, nakon izvršenja analize, pored detektovanog obrasca, navodi se pretpostavljena speciičnost autoantitijela odgovornih za detektovani obrazac, kao i njihov dijagnostički značaj. To je naročito važno za ona autoantitijela koja dalje ne možemo da potvrdimo drugim testovima.
Metoda IIF je semikvantitativna. To znači da se rezultat izražava kroz intenzitet detektovane florescencije, od 1 do 4+, ili kroz titar-antitijela. I jedna i druga navedena metoda predstavljaju samo relativnu, ni u kom slučaj preciznu evakuaciju količine antitijela. Pri evakuaciji nalaza treba imati u vidu da je prevalenca ANA u populaciji zdravih različita u odnosu na prevalencu u grupi oboljelih od autoimunskih bolesti i s tim u vezi, dijagnostički značaj ANA u velikoj mjeri zavisi od od kliničkih manifestacija kod određenog pacijenta. Zato, rezultat analize se isključivo može evaluirati u kontekstu kliničkih manifestacija koje pacijent prezentuje, te je dovoljno informativna uputna dijagnoza, od velikog značaja imunologu za evaluaciju rezultata. Npr. nalaz slabo pozitivnih ANA kod starijih pacijenata ne mora da bude indikator bolesti te u takvom slučaju potvrdne testove nije neophodno uraditi ukoliko ne postoji jasno definisana klinička indikacija.
Pitanje kliničkog značaja antinuklearnih antitijela veoma je kompleksno. Kada su otkrivena, smatralo se da su specifčna za sistemski eritemski lupus, međutim, vrlo brzo je postalo jasno da se detektuju u relativno visokom procentu i kod osoba oboljelih od drugih sistemskih bolesti, organ-specifčnih autoimunskih bolesti, ali i kod bolesnika sa raznim neautoimunskim bolestima. Tako se ova antitijela mogu detektovati i kod bolesnika sa autoimunskim, ali i virusnim i drugim bolestima jetre, bolestima respiratornih organa, hroničnim alergijskim bolestima, malignim bolestima, infektivnim bolestima (naročito pojedinim virusnim i hroničnim bakterijskim), kao posljedica uzimanja određenih lijekova, a u određenom procentu i kod zdravih osoba (do 3% mladih, odnosno i do 20% zdravih osoba starijih od 60 godina). U svim ovim slučajevima nalaz antinuklearnih antitijela nema dijagnostički i klinički značaj.
Dijagnostički značaj određenog testa za pojedine bolesti najčešće se opisuje kroz njegovu dijagnostičku osjetljivost i specifčnost. U praksi se smatra da je klinička osjetljivost (senzitivnost) testa za određenu bolest velika ukoliko je rezultat testa pozitivan kod većine oboljelih od te bolesti (detektuje „sve oboljele”), dok je klinička specifčnost testa za određenu bolest velika ako se detektuje velik broj negativnih nalaza u populaciji u kojoj ta bolest ne postoji (detektuje „samo oboljele od date bolesti”). Npr. na osnovu višedecenijskog istraživanja došlo se do zaključka da je klinička osjetljivost (senzitivnost) testa IIF za detekciju ANA za dijagnozu SLE veoma velika, pošto se ANA detektuju kod 98-99% oboljelih, tj. praktično su izuzetno rijetki bolesnici sa SLE kod kojih se ANA tehnikom IIF ne mogu detektovati. Upravo zbog ovako velike kliničke senzitivnosti ANA za dijagnozu SLE, njihov nalaz je svrstan u revidirane kriterijume Američkog reumatološkog društva (ARD) za dijagnozu SLE. S druge strane strane, klinička specifčnost ukupnih ANA detektovanih metodom IIF relativno je mala (oko 49%), upravo zato što se ANA mogu detektovati u sklopu niza drugih bolesti, pa i kod zdravih, što znači da pozitivan rezultat ne potvrđuje dijagnozu SLE-a.
Međutim, ukoliko bi iz te heterogene populacije ukupnih ANA izdvojili pojedina specifčna antinuklearna antitijela, pokazalo bi se da specifčnost pojedinih ANA može biti visoka za SLE, ili pak neke druge bolesti, te takva antitijela u rutinskoj praksi postaju „markeri” pojedinih bolesti (npr. anti Sm antitijela za SLE, anti Scl-70 antitijela za sistemsku sklerozu…).
Ipak, s obzirom na to da je osjetljivost ovih pojedinih specifčnih ANA za date bolesti mala, npr. anti Sm antitijela se detektuju u svega 10-40% SLE pacijenata, imunološko testiranje bolesnika sa sumnjom na postojanje neke sistemske bolesti vezivnog tkiva (SBVT) počinje primjenom osjetljivijeg testa IIF za detekciju ukupnih ANA kao najosjetljivijeg i najnespecifčnijeg pokazatelja, a u slučaju pozitivnog nalaza nastavlja se sa primjenom specifčnijih metoda za dokazivanje pojedinih specifčnih ANA koje mogu biti odgovorne za nalaz karakterističnog obrasca na IIF preparatu.
Da bi rezultat analize ANA na Hep-2 substratu bio adekvatan i pouzdan, neophodno je da bude ispunjeno nekoliko pretpostavki: od kvalitetnog Hep-2 preparata, koga dobijamo komercijalnim putem, adekvatnog izbora početnog razblaženja (da bi izbjegli veliki broj „lažno pozitivnih” rezultata), upotrebe odgovarajućih antiseruma i kontrolnih seruma, servisiranog i uvijek održavanog kvalitetnog luorescentnog mikroskopa, i konačno, obučenog kadra koji je upoznat sa svim obrascima i njihovim značajem.
Od prednosti ove metode, sem što je tehnički jednostavna i relativno jeftina, najznačajnija je velika osjetljivost na dijagnozu sistemskih bolesti vezivnog tkiva. Ona nam omogućava da iz jednog uzorka u relativno kratkom vremenskom roku dobijemo podatke o svim relevantnim autoantitijelima u serumu bolesnika. Glavni nedostaci ove metode su:
subjektivnost (da li će određeni obrazac biti evidentiran i koji intenzitet luorescence će biti registrovan, zavisi u velikoj mjeri od posmatrača, ali i karakteristika preparata), potreba za visoko obučenim kadrom, odsustvo automatizacije ( i potreba za većim utroškom radnog vremena tehničkog osoblja i ljekara), nizak nivo standardizacije (od proizvodnje preparata do tehničke izvedbe procedure), slabe mogućnosti za adekvatno vođenje dokumentacije. Glavni zahtjevi dobre laboratorijske prakse (standardizacija i dokumentacija) onemogućeni su prije svega zbog osnovnih karakteristika mikroskopske tehnike i postojanja velikog broja varijabli na koje utiču brojni subjektivni i objektivni faktori.
Zbog svega gore navedenog, uprkos kvalitetnom dijagnostičkom laboratorijskom postupku, nerijetko se detektuje relativno velika međulaboratorijska kao i unutar-laboratorijska varijabilnost dobijenih rezultata za pojedinačne pacijente.
(U narednom broju ELISA metoda)
Piše: dr Tamara Jovićević, imunolog Centar za medicinsku genetiku i imunologiju, KCCG
Dodajte komentar